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Elabscience一步法TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是一款靈敏度高且能快速簡便的檢測細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品。本試劑盒適用于組織樣本(石蠟切片、冰凍切片)和細(xì)胞樣本(細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片)的原位凋亡檢測，檢測結(jié)果可通過熒光顯微鏡直接觀察。那么你知道Elabscience一步法TUNEL原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒該怎么用嗎？讓我們一起來看看吧！
一、試劑配制
1) 1×蛋白酶K工作液：取1μL Proteinase K (100×) 加入99μLPBS中，混勻?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
2) 1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 將DNase I Buffer (10×) 稀釋待用。現(xiàn)配現(xiàn)用。
3) DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作液，按照 99：1 稀釋比將 DNase I (20 U/μL) 稀釋待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
注：DNase I 會(huì)在劇烈混合下變性，建議不要渦旋
DNase I 溶液。
4) DAPI工作液：取4μLDAPI Reagent(25μg/mL)加入96μL PBS中混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
二、固定與通透
1. 細(xì)胞樣本
1) 細(xì)胞爬片：將細(xì)胞爬片浸入PBS漂洗1次，濾紙吸干周圍水分，再浸入固定液（自備），室溫固定 15~20 min 或4°C固定1~2 h。
細(xì)胞涂片：收集細(xì)胞，加入一定體積的 PBS 重懸細(xì)胞沉淀，然后加入和PBS等體積的固定液（自備），室溫固定15~20 min 或 4°C固定1~2 h。600×g 離心 5 min，PBS重懸，取25~50μL細(xì)胞懸液涂片在載玻片上晾干。
注：細(xì)胞固定是分析凋亡樣本的重要步驟。未固定的細(xì)胞可能會(huì)丟失較小的 DNA片段，導(dǎo)致較低的信號(hào)。
2) 固定好的樣本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
3) 將樣本浸入通透液（自備）中，37°C 作用 10 min。
4) 將通透好的樣本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。
2. 石蠟切片
1) 用常規(guī)方法將切片脫蠟水化。將切片浸入二甲苯（自備）脫蠟2次，每次10 min；無水乙醇（自備）浸泡切片2次，每次5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自備）各一次，每次 3 min。
注：低溫可能影響二甲苯脫蠟效果。當(dāng)室溫低于 20°C 時(shí)，二甲苯脫蠟時(shí)間可延長至 20 min。
2) 脫蠟好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
3) 濾紙吸干切片組織周圍的水分，每個(gè)樣本上滴加100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反應(yīng) 20 min。
注：不同組織或物種的樣本反應(yīng)時(shí)間可能不同。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定反應(yīng)時(shí)間。
4) 將通透好的樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5min。
3. 冰凍切片
1) 取出冰凍切片，平衡至室溫，再浸入固定液（自備），室溫（15~25°C）固定 30 min。
2) 固定好的樣本浸入 PBS 漂洗2次，每次5 min。
3) 每個(gè)樣本上滴加100 μL 1×蛋白酶K工作液，37°C 反應(yīng)10~20 min。
注：不同組織或物種的樣本反應(yīng)時(shí)間可能不同。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定反應(yīng)時(shí)間。
4) 將通透好的樣本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。
三、標(biāo)記
1. 分組設(shè)置
分組 | 樣本選擇 | 特點(diǎn) | 目的 |
陽性對(duì)照 | 任選一張實(shí)驗(yàn)組切片 | 可選做，DNase I處理切斷 DNA，產(chǎn)生暴露的 3'-OH末端，作為陽性樣本 | 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程和試劑的有效性 |
陰性對(duì)照 | 任選一張實(shí)驗(yàn)組切片 | 可選做，標(biāo)記工作液中不含 TdT酶 | 排除樣本自發(fā)熒光及樣本和染色試劑的非特異性染色；調(diào)整曝光強(qiáng)度 |
實(shí)驗(yàn)組 | 待檢測切片樣本 | 必做，孵育標(biāo)記工作液，保持實(shí)驗(yàn)檢測條件的一致性 | 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來源 |
陽性對(duì)照
1) 滴加100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的樣本上, 室溫平衡5 min。
2) 用吸水紙去除樣本上多余的液體。加入100 μL稀釋后的DNase I工作液（200 U/mL)，37°C孵育10~30 min。
3) 樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
陰性對(duì)照
1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的樣本上，室溫平衡 5 min。
2) DNase I Buffer孵育陰性樣本，37°C 孵育10~30 min。
3) 樣本浸入PBS漂洗3次，每次 5 min。
實(shí)驗(yàn)組
1）實(shí)驗(yàn)組通透完成后在PBS中靜置，等待陽性對(duì)照和陰性
對(duì)照處理后共同進(jìn)行標(biāo)記染色。
2. 標(biāo)記工作液的配制
計(jì)算好樣本量集中配置，每個(gè)樣本用量按照下表配制，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。
組分 | 陽性對(duì)照/實(shí)驗(yàn)組 | 陰性對(duì)照 |
TdT Equilibration Buffer | 35 μL | 40 μL |
Labeling Solution | 10 μL | 10 μL |
TdT Enzyme | 5 μL | 0 μL |
3. 標(biāo)記步驟
1) 每個(gè)樣本滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，37°C 濕盒中平衡 10~30 min。
2) 吸水紙吸除TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每個(gè)樣本滴加50 μL標(biāo)記工作液，放入濕盒中37°C避光反應(yīng)60 min。
注：如果信號(hào)強(qiáng)度較弱，則可延長 DNA 標(biāo)記反應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間。某些系統(tǒng)可能需要在37°C下反應(yīng)4小時(shí)。
3) 樣本浸入 PBS 漂洗3次，每次5 min。
4) 吸水紙吸干水分后滴加DAPI工作液，室溫避光孵育5min，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。
5) 樣本浸入PBS漂洗4次，每次 5 min。
6) 用吸水紙吸干多余的液體，用含抗熒光淬滅劑（自備）的封片劑封片。
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